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漸漸習慣了現代生活的美國隊長史蒂夫·羅杰斯（克里斯·埃文斯 Chris Evans 飾），在一次行動后隱隱嗅到神盾局內部所彌漫出來的兇險氣味。而當得知神盾局正秘密進行的“洞察計劃”后，他更為此感到憤怒。某天，神盾局指揮官尼克-法瑞（塞繆爾·杰克遜 Samuel L. Jackson 飾）遭到一群武裝分子襲擊，他拼盡全力將一支U盤交到美國隊長手中，這里面藏著該局二戰以來最重要且最可怕的秘密。在此之后，美國隊長因涉嫌殺害尼克而遭到前局長亞歷山大·皮爾斯（羅伯特·雷德福/Robert Redford 飾）的通緝和追殺，逃亡中他得到黑寡婦（斯嘉麗·約翰遜 Scarlett Johansson 飾）和退伍老兵“獵鷹”（安東尼·麥凱 Anthony Mackie 飾）的幫助。　　他們必須爭分奪秒解開神盾局的秘密，阻止“洞察計劃”的施行………